时间：2023-07-15 17:56:34 点击次数：11
转自：优宁维抗体专家
qRT-PCR（实时荧光定量PCR）是RNAi的标准检测方法，今天小优就以一个siRNA沉默mRNA的案例来展示如何进行计算吧~
RNAi实验的步骤
本案例采用实时一步RT-PCR分析CDC2基因敲除情况。流程如下：
步骤一
siRNA转染 —— HeLa S3细胞转染靶向人类CDC2基因的0.5 nM siRNA、阴性siRNA对照（与任何已知的哺乳动物基因没有同源性的非沉默对照siRNA）。并添加未转染细胞作为对照。
步骤二
RNA纯化 —— 48小时孵育后，收集细胞，使用试剂盒纯化RNA。
步骤三
使用以上RNA为模板进行qRT-PCR。使用一步法qRT-PCR试剂盒，（逆转录反应和扩增在同一试管中进行）。进行CDC2和GAPDH（一种管家内源性参考基因）的基因特异性定量。
qRT-PCR还需要注意以下内容
（1）无模板对照NTC：这是一个无模板RNA，可用ddH2O补足，包含扩增反应的所有成分。NTC可以检测到qRT-PCR反应组分中可能存在的任何污染。
（2）内源性内参基因的标准化：内源内参基因是指表达水平在样本之间不存在差异的基因。将目的基因与内源性内参基因进行比较，可纠正RNA含量的变化和样本处理中的其他差异。在本实验中，使用管家基因GAPDH进行归一化。
（3）来自未转染细胞的模板：对未转染对照的分析显示，在没有任何处理的情况下，基因表达水平。
（4）来自阴性siRNA对照的模板：将转染阴性siRNA对照的细胞中的靶基因表达与转染基因特异性siRNA后的基因表达进行比较，计算基因敲除率。
未转染对照组的基因表达水平应与转染阴性siRNA对照组观察到的水平进行比较。二者基因表达应该是相似。这两个样本之间的任何基因表达差异都是由非特异性效应引起的。
（5）每个样本至少重复2次
重复实验对于解释样本间的变化很重要，以确保数据是可靠和稳健的。至少应进行2次重复实验，重复之间的差异应较低。为了确保变异是可接受的低水平，计算变异系数（%Cv=（标准偏差（重复）/平均CT（重复））x100）。这一点应该始终低于3%。
步骤四
结果分析：获取到可信的CT值，进行计算。本实验数据如下：
分组
CT值
CDC2-
specific
PCR
3个重复
平均值
GAPDH-
specific
PCR
3个重复
平均值
转染
CDC2
细胞
26.04
26.20
26.42
26.22
15.27
15.38
15.81
15.49
转染
阴性
siRNA
对照
细胞
22.90
23.13
22.34
22.79
15.18
15.41
15.25
15.28
使用∆∆CT方法计算siRNA沉默效率，计算公式如下：
靶基因表达=2-∆∆CT
∆CT (样本) = CT 靶基因– CT内参基因
∆CT (对照) = CT 靶基因 – CT内参基因
∆∆CT = ∆CT (样本) – ∆CT (对照)
本实验数据带入公式计算：
∆CT(样本) = 26.22 – 15.49 = 10.73
∆CT (对照) = 22.79 – 15.28 = 7.51
∆∆CT= 10.73 – 7.51 = 3.22
样本中靶基因表达= 2-3.22 = 0.107，CDC2 siRNA对样本的沉默效率为：100%-10.7% = 89.3%
一般来说，下调70%或以上被认为是显著高的。然而，根据细胞类型、靶基因和下游检测的不同，较低的敲低水平可能也就足以用于RNAi研究。
其他的基因调控实验，如miRNA mimic，cDNA等均可以使用同样的方法进行计算。
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